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突变频率AF的稀释：野生型不含突变的细胞系核酸与含有特定突变的细胞系核酸进行混合，对于AF突变频率的稀释通常不能简单考虑野生型核酸及突变核酸的质量比，而需要突变基因位点的原始频率，突变及野生型基因核酸所含的目的基因拷贝数，野生及突变型核酸样本的基因组整体分子量（染色体倍性）等多个维度进行考虑，6163银河线路检测中心生物开发了一套独特的算法，将上述因素均纳入该计算方法中，使得计算的理论突变及野生型核酸混合比例最大程度的精确，同时对稀释后的样品进行数字PCR绝对定量，再根据定量的结果对与理论AF%值有一定偏差的结果进行微调以后再次数字PCR定量，使得稀释样品的AF%处于使用预期的合理范围内浓度的稀释：一般gDNA浓度在40ng/ul，如果需要低浓度，那么使用对应的缓冲液对产品进行稀释。

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6163银河线路检测中心的突变频率AF是通过数字PCR检测的，误差范围如下：

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AF检测结果不符合预期的原因可能是多方面，通常有以下几个常见的原因，1）技术平台方法学的差异，COA呈现的AF值及误差范围是基于数字PCR绝对定量计算的结果，当标准品用其它方法学检测时(例如NGS),这种AF的偏差可能被放大，这种放大又和检测突变的类型，目的基因的拷贝数及序列的特殊性，样本的染色体倍性，具体采用的实验技术路线，以及后期的生信分析方法相关，具体来说1）当突变为SNV时一般数字PCR与NGS获得的AF值偏差较小，而CNV及融合突变的AF值偏差较大，从实验的角度数字PCR是完整的gDNA样品进行一个扩增定量，而NGS建库过程中往往需要对样品进行打断，打断通常容易使CNV及融合突变的AF与打断前发生一定的偏差，我们用数字PCR对打断前后的CNV及融合突变样品检测往往也会观察到这个现象，这种打断以后产生的差异我们在一些整体染色体倍性异常的样品上也有所发现, 另外从检测后的生信分析角度来看，SNV AF值的计算分析方法相对成熟统一，也更接近于数字PCR AF值的计算原理，所以NGS和数字PCR结果之间往往差异较小，而CNV和融合突变的AF计算更依赖于生信算法，方案不太统一成熟，各家算法差异较大，这也是导致其与数字PCR定标AF存在较大差异的原因之一。此外，从方法学角度，数字PCR只是简单的一次PCR的绝对定量方法，而NGS方法无论是扩增子还是捕获方案，建库及测序过程中可能都涉及多次或多重PCR，PCR的过程会产生一些偏向性扩增，导致AF值发生一定偏离，我们也曾通过一些数字PCR实验验证发现某些样本和位点建库前和建库后的PCR产物AF值存在差异；另外，某些NGS测序深度不足或者不均一也会导致AF值与预期不符，例如某些GC含量过高或过低的区域位点，可能会存在深度与其它区域比不均一的情况，导致AF偏离， 另外对于某些拷贝数扩增，且扩增数比较高的位点，会存在局部测序深度不够，导致检测上限低于真实拷贝数，需要更高的测序深度才能反映真实的拷贝数。

以上只是一些常见的AF值偏离的原因，总而言之，AF值不符的原因是多方面且复杂的，具体案例还需要具体分析，当遇到实际案例时可能我们需要客户的一些原始数据和实验细节才能便于我们分析原因。

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6163银河线路检测中心生物的标准品来源的细胞系是含有一些内源性突变的，这些突变的全外显子测序结果可以在购买后咨询我们的销售人员获取。

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160bp±10%的DNA片段，模拟液体活检病人样本；由①gDNA超声打断或②酶切处理染色体后提取获得；可提供纯化后的ctDNA片段，也可以将ctDNA 按一定的浓度溶入人工血浆中模拟临床上未纯化的血浆样本，我们一般不对产品提供末端修复，客户可根据自己的应用场景需要自行进行修复。

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FFPE标准品是将一定数量的特定突变细胞福尔马林固定，包埋形成石蜡块形式；石蜡块切片制作为石蜡切片形式。

试剂盒：

QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen)

Qubit dsDNA HS Assay Kit (Thermo Fisher Scientific) 

规格提取量：>400 ng per two slides with 15 μm/slide

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参考 从《指导原则》中分析参考品盘设计

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1）数字PCR的引物探针针对SNV，或者较短的Indel (如EGFR 19Del, 20Ins等)，通常包含一对引物，以及两条分别标记不同荧光基团（例如FAM/VIC, FAM/HEX等）的探针用于识别突变及野生型拷贝数。

2）数字PCR的引物探针针对CNV,通常包含两对不同的引物及两条标记不同荧光基团（例如FAM/VIC, FAM/HEX等）的探针，用于分别扩增识别定量目的基因及内参基因的拷贝数。（内参基因一般选择较为保守不易发生拷贝数变异的基因，例如RPP30，尽管内参基因拷贝数相对保守，不易发生拷贝数异常，但这不是绝对的，有时为了提高检测的准确性，可以考虑选择两到三个不同的内参基因来比较，提高检测的准确性）。

3）数字PCR的引物探针针对DNA融合突变，通常包含两对不同的引物及两条标记不同荧光基团（例如FAM/VIC, FAM/HEX等）的探针，用于分别扩增识别定量目的基因突变BREAKPOINT拷贝数及总的目的基因拷贝数。

4）数字PCR的引物探针针对RNA，通常包一对引物及一条标记荧光基团的探针，用于扩增识别定量目的基因拷贝数。